本文首发于公众号「呼气试验」，此处为归档版本。
本文介绍了呼气试验在肝病诊断与监测中的应用。非酒精性脂肪肝等肝病日益普遍，呼气分析可非侵入性地检测挥发性有机物，评估肝功能，区分肝性脑病等疾病，并有望通过监测柠檬烯等标志物实现早期预警和个性化治疗支持。
1、肝病的流行
西方国家健康状况不佳的指标之一是与饮酒无关的肝脏疾病的发病率和严重程度不断上升。英国的数字表明，每10人中就有3人受到非酒精性脂肪肝（NAFLD）的影响，而对于超重、肥胖或患有II型糖尿病的人来说，患病率甚至更高。研究还将某些污染物和工业化学品与肝病发生率的增加联系起来。也许最令人担忧的是儿童非酒精性脂肪肝的发病率，目前在美国2至19岁的儿童中，非酒精性脂肪肝的发病率高达10%。非酒精性脂肪肝是一个重要的研究领域，NIH（美国国立卫生研究院）列出了300多项目前正在调查该疾病的临床试验。
虽然非酒精性脂肪肝本身对医疗的影响很小—而且一般来说，肝病可以在一段时间内保持无症状状态—但它可能是更严重的肝脏疾病的前兆，包括肝硬化、肝纤维化和肝细胞癌。因此，非酒精性脂肪肝可能是一个关键的早期预警信号，如果能准确检测出来，就可以在肝功能受到损害和对健康的负面影响变得明显之前采取预防措施。
大多数非酒精性脂肪肝患者不会发展为其他疾病，但约有20%的人发展为非酒精性脂肪肝炎（NASH），在这种情况下，并发症变得更有可能。在越来越多的国家，肝脏疾病对健康的累积影响是对医疗资源的重大和不断增长的使用。因此，迫切需要技术来可靠地检测和监测非酒精性脂肪性肝炎的进展情况。
图1 2018年非酒精性脂肪肝的估计流行率
图2 从健康的肝脏发展到肝硬化、肝衰竭和/或癌症涉及多个阶段和明显的生理变化
2、肝脏疾病的测试
目前，诊断肝脏疾病的黄金标准是组织活检。 这需要一个侵入性的程序，与发病率和高成本相关，所有这些都禁止在早期诊断中广泛使用。此外，活检只收集了少量的肝脏组织样本，因此可能无法代表整体的肝脏健康。开发一种可靠的非侵入性肝脏健康测试可以拯救生命，并大大减少医疗系统的压力。
由于这些疾病的普遍性，对药物的需求也很高，以帮助治疗和延迟疾病的发展。对NASH的药物治疗正在进行特别广泛的调查，一个合适的非侵入性测试将通过在临床试验期间对肝功能和健康的密切监测来加速药物发现过程。
已经采取了各种方法，通过检测新陈代谢的生物标志物来监测肝脏健康。一些研究已经确定了晚期肝脏状况的血液生物标志物，包括肝性脑病（肝功能受损影响大脑健康）和癌症。 其他调查也强调了使用粪便样本或尿液作为肝脏生物标志物非侵入性来源的潜力。
然而，血液采样仍然是侵入性的，而且作为一种采样方法并不总是实用。同样，现有的基于粪便采样的筛查项目—如大肠癌的粪便隐血筛查—由于需要做一些不愉快的工作，在普通人群中的接受度很低。
3、FAIMS用于肝性脑病
Owlstone Medical的FAIMS技术已经被用于分析肝性脑病（HE）患者的呼吸。肝性脑病是一种神经精神疾病，当肝脏不能充分清除血液中的毒素时就会发生。它可以突然发生在急性肝衰竭的人身上，但更多地是出现在慢性肝病患者身上。
据报道，30-84%的肝硬化患者有轻微的HE（可检测到的最温和的HE）。这对日常功能产生了深远的影响，近50%的轻度HE患者可能不适合维持就业。使用利福昔明可以有效地治疗这种情况，早期发现可以防止肝病的发展和住院治疗。
在Arasaradnam等人的一项试点研究中，使用装有紫外线电离源的Lonestar VOC分析仪分析了HE患者和对照组的呼吸样本的化学指纹。共招募了42名患者：22名HE患者（13名隐性HE患者和9名显性HE患者）和20名健康对照。
对提取的数据进行分析，并使用特征选择来确定关键变量（使用Wilcoxon秩和测试分别适用于每个特征），结果特征集被用来分别训练四个分类器（稀疏逻辑回归、随机森林、支持向量机和高斯过程）。
图3 区分HE与对照组的接受者操作曲线（ROC）图
对呼出的VOCs进行FAIMS分析，能够将HE患者与对照组进行分类，其敏感性和特异性分别为0.88（0.73-0.95）和0.68（0.51-0.81），AUC为0.84（0.75-0.93）。
这项试点研究提供了证据，证明呼吸道VOC生物标志物分析有可能作为一种诊断辅助手段，将所有等级的HE与健康对照受试者区分开来，并进一步表明VOC生物标志物有可能作为一种辅助手段来区分隐蔽的和公开的HE形式。
4、肝脏疾病的呼吸生物标志物
作为一种非侵入性的、可持续的收集方法，呼气分析为早期疾病的检测和监测提供了一个可取的选择。肝脏处理代谢物的关键功能也使其成为可在呼吸中排泄的挥发性有机物的丰富来源。因此，呼吸活检非常适用于肝脏疾病的生物标志物的发现，并可以提供重要的代谢信息，以实现早期诊断。
肝脏的突出地位和已经提出肝病呼吸生物标志物的研究数量，使其成为诊断测试开发的最佳目标，有可能有效地应用以假设为主导的、有针对性的和无假设的、无针对性的分析。
4.1 现有的研究
希波克拉底是最早将肝脏疾病与他所谓的 “肝臭”（fetor hepaticus）联系起来的人之一，肝脏严重衰竭会产生难闻的气息。我们现在知道，衰竭的肝脏停止处理含硫化合物，结果在血液中积聚，转移到肺部的空气中，使呼出的气体具有明显的气味。肝胎儿的存在为肝脏健康和呼吸之间的关系提供了一个极端的说明。它强调了检测肝脏早期细微变化的机会，最近的研究已经开始提出基于呼吸的肝脏疾病的生物标志物。
表1 文献中报道的肝病VOC生物标志物
在一组102人中，Van den Velde等人（2008年）通过使用GC-MS专门研究了与肝硬化有关的气味。二甲基硫醚、丙酮、2-戊酮和2-丁酮的升高表明了肝硬化的存在，而吲哚和二甲基硒的含量则降低。二甲基硫化物是肝脏的一种已知成分。由此产生的模型以1.00的灵敏度和0.70的特异性检测出肝硬化。四年后，同一小组扩大了他们的调查范围，探索所有的VOCs，开发了能够达到1.00灵敏度和0.83特异性的模型。
另一项研究将离子分子反应质谱法（IMR-MS）应用于129份呼吸样本，这些样本来自健康人和肝硬化、非酒精性脂肪肝和酒精性脂肪肝（AFLD）患者的组合。该调查使用堆积特征排序来识别生物标志物，并报告了一系列的比较，包括乙醛、M103、异戊二烯、M67和M60作为AFLD与健康人的鉴别因素。该方法还能够使用包括VOC乙醛（酒精脱氢酶途径中的一种化合物）在内的模型来区分疾病与对照样本。
同一项研究在肝硬化患者的呼吸中发现了乙醇，这是由于肝硬化患者无法氧化内源性的乙醇。乙醇也被认为是非酒精性脂肪肝的生物标志物，而Letteron等人检查了近200个样本，确定乙烷和戊烷是酒精对肝脏影响的指标。这些简单的烷烃是脂质过氧化途径的产物，它受到氧化应激的刺激，是肝病的一个常见症状。已知酒精在肝脏中会引发细胞色素P450（CYP450）酶家族成员的激活，正是这一点可能导致酒精相关肝病中的烷烃产量特别高。
在一项针对123个样本的研究中，戊烷也很重要，该研究考察了酒精性肝炎的肝硬化和失代偿期非酒精性肝硬化与健康对照组的对比。选定离子流管质谱法发现了六种与肝病有关的挥发性有机物（2-丙醇、乙醛、丙酮、乙醇、戊烷和三甲胺）。三甲胺和戊烷在酒精性肝炎患者中特别高，这些化合物形成了一个识别病情的模型，AUROC为0.92。三甲胺是由肠道微生物组产生的，通常由肝脏处理，目前还不清楚为什么与酒精有关的情况似乎对其在呼吸中的丰度有更大的影响。
一项对69人的较小的调查也比较了相对于有害饮酒者和健康对照者的酒精性和非酒精性肝硬化以及进展为肝性脑病的情况。可靠的模型能够区分各种群体，包括区分非酒精性肝硬化、酒精性肝硬化和有害饮酒者与健康对照者，其灵敏度分别为0.92、0.97和1.00。
2013年，Verdam等人报告了他们在65名超重和肥胖患者中寻找NASH的VOC生物标志物，这些患者在其他计划的手术过程中收集了活检结果。该研究确定了一个基于正十三烷、3-甲基丁腈和1-丙醇的模型，可以诊断NASH，AUROC为0.77。作为NASH的预测指标，呼吸分析的表现明显优于血浆，假阴性结果的减少尤为明显（67-79%减少到10%）。
4.2 肝病与儿童
肝病给我们的医疗系统带来了不同寻常的挑战，因为它不纯粹是一种老年疾病。在发达国家，许多日益增长的健康问题都与预期寿命的延长和年龄的增长有关，而肝病则与不良的饮食和营养有着更密切的联系，因此越来越多的儿童被诊断出患有慢性肝病。
Eng等人收集了104名6至21岁儿童的样本，以确定慢性肝病儿童呼吸样本中四种升高的（1-癸烯、1-庚烯、1-辛烯和3-甲基己烷）和三种降低的（1-壬烯、（E）-2-壬烯和二甲基硫化物）VOC丰度。使用这些VOCs中的五种，他们能够创建一个高准确度的模型，接受者操作特征下面积（AUROC）为0.97。同一小组的一项较小的研究使用60名儿童的样本检查了非酒精性脂肪肝，以确定异戊二烯、丙酮、三甲胺、乙醛和戊烷为生物标志物，并生成一个AUROC=0.91的模型。这项研究还包括一个验证组，同一模型的AUROC为0.76。
4.3 柠檬烯—一个强有力的肝功能生物标志物
呼气采样的主要好处之一是能够定期和重复地收集病人的样本。一项对肝移植患者的纵向研究发现，柠檬烯、甲醇和2-戊酮是肝硬化的诊断标志物，柠檬烯在成功的移植手术后显示出冲淡的动力学。
同一小组还将柠檬烯确定为肝性脑病的指标，并显示其水平随疾病的发展而变化。柠檬烯提供了一个特别明显的例子，说明呼吸中的挥发性有机物已被可重复地确定为肝功能的标志物。
图4 (左)波谱图显示了31名肝硬化患者、30名对照组和室内空气样本的柠檬烯的下四分位数(LQ)、中位数、平均值和上四分位数(UQ)的计算体积混合比(VMR)。(右图) F2、F4、F5、M3和M7患者在肝移植后特定天数的柠檬烯的VMR纵向变化。
5、肝脏、健康和CYP450代谢
肝移植后呼出的柠檬烯水平的降低不仅仅是一个有趣的相关效应。柠檬烯是一种在食品中发现的化合物，被广泛认为是一种食品添加剂。在体内，柠檬烯由CYP2C9和CYP2C19这两种CYP450家族成员的肝脏酶处理。因此，移植后恢复健康的肝功能会直接降低柠檬烯的水平。原则上，可以通过呼吸测试来施用和监测柠檬烯，作为评估肝功能的一种方式。
如前所述，CYP450家族的酶在肝脏代谢中起着重要作用，它们在药理学上也有很大的意义。CYP450是由100多个基因产生的一大组蛋白质。尽管这个家族具有多样性，但仅仅四个CYP450变体就参与了70%以上的现代药物的处理。这些蛋白质主要存在于肝脏中，这些蛋白质的丰度变化（无论是先天性的还是病理性的）可以影响个人对药物治疗的反应。
图5 细胞色素P450酶在药物代谢中的作用
CYP450蛋白通常会以两种方式之一与药物发生作用，要么将原药物转化为其活性形式，要么将活性药物代谢为非活性化合物。因此，不同的CYP450酶的速率可以极大地影响药物活性的速度和强度以及药物停止工作的速度。如果我们能够在开始治疗之前更深入地了解病人的CYP450酶将如何处理一种药物，这将简化制定有效的、个性化的治疗方案的任务，同时避免有害的副作用。
目前，在开具新药处方时，需要进行一定程度的猜测和试验，以使剂量与个人的CYP450活性相匹配。 这是一个艰巨而昂贵的过程，只会拖延为病人提供正确的治疗。在最好的情况下，这可能意味着无效的治疗，在最坏的情况下，意味着使人衰弱的副作用。柠檬烯所展示的是一种有效的、非侵入性的方法，有可能被开发为一种快速评估CYP450酶活性的方法。
6、探针新陈代谢
某些代谢酶的化学探针提供了一种评估代谢率的方法，以便为广泛的条件下的优化治疗提供信息。 一些研究已经使用13C同位素标记的酶底物作为探测酶活性的一种方式。标记的碳可以被口服，并最终被处理成13CO2，在呼出时可以被检测到。例如，13C-甲基丙酮已被用于一些案例中，以评估纤维化引起的肝脏损伤。
虽然同位素标记是一种可行的方法，但同位素标记的化合物的使用往往受到严格的管制，这些探针的检测取决于它们是否代谢成特定的产品。此外，13C同位素探针一次只能使用一个，因为每个探针的读数都是一样的。使用VOC检测的类似方法可以获得类似的结果，同时克服这些限制。
7、肝脏疾病的呼吸分析的下一步是什么？
呼出的VOCs被应用于肝脏疾病的检测、诊断和进展监测的潜力是显而易见的，然而，要确定不同条件和阶段的可靠的生物标志物，并使其具有广泛的临床用途，仍需进行研究。
如果我们想看到呼气分析成为肝脏保健中的一个公认的工具，那么现有的研究有几个共同的关键限制，需要加以解决。值得注意的是，许多研究结果都是基于对小量呼吸的分析—一次呼吸、一个20毫升的瓶子或1升的体积—这对试图从小量的源材料中有意义地识别VOCs造成了分析上的挑战。 典型的呼吸收集方法也收集整个呼吸，包括来自口腔和呼吸道的空气，只选择肺泡空气的方法将是一个更丰富的肝脏VOCs来源。
迄今为止的研究通常是基于有限地理范围内的少量样本，因此需要在更广泛的环境中应用基于呼吸的方法，以形成对各种肝脏疾病导致的挥发性有机化合物变化的真正代表性观点。