本文首发于公众号「呼气试验」，此处为归档版本。
利用呼吸样本来确定与健康和疾病相关的变化并不是一个新概念。几十年来，研究人员一直在研究呼气中的气体成分以及呼出空气中的挥发性有机化合物 (VOC)，以进一步了解我们的生物学和健康状况。在基因组学时代，新技术以及对高通量生物分析和代谢组学的日益重视有助于拓展呼吸研究领域，人们对呼吸组学的兴趣也迅速增长。
呼吸测试提供了一种直接、无创的方式来监测我们的生物学，为早期检测疾病和精准医疗提供了一种潜在的工具。在此，我们将探讨一些方法学、生物学和分析方面的挑战，这些挑战是在设计呼吸研究以产生有价值的高质量结果时必须考虑的。
01
—
严格的研究设计和验证
疾病生物标志物必须经过彻底验证，才能用于诊断疾病和选择治疗方法。这对寻求美国食品及药物管理局等机构监管批准的测试至关重要。迄今为止，大多数呼吸研究都只关注生物标记物的发现。因此，针对各种疾病提出了许多呼气生物标记物，但得到充分验证的却很少。这些研究共同证明了呼气分析的广泛潜力，但现在需要根据审批程序和应用情况直接设计更多的研究。
发现性研究通常规模较小，往往从单一地点收集样本。这就造成了数据过度拟合的问题，即样本量小不能适当代表更广泛的人群。因此，基于数据的判别模型在应用于新数据集时表现不佳。在理想情况下，任何前瞻性模型都应使用独立队列进行验证。《诊断准确性研究报告标准》（STARD）指南和《介入性试验标准协议项目》（Standard Protocol Items：干预试验建议》（SPIRIT）声明为研究设计提供了指导，鼓励在研究设计的最初阶段考虑质量验证的必要性。此外，还需要在其他研究人员已发表结果的基础上开展更广泛的确证研究。
为了真正具有代表性，验证研究必须招募属于预期使用人群的受试者，而不仅仅是发现研究的复制品。这样才能确保鉴别模型能够得到有效应用，并满足监管部门的审批要求。与生物标记物发现集相比，这类人群和用户设置通常会引入更多的现实生活变异性。
通过研究目标挥发性有机化合物生物标志物的生物起源，确定其与相关代谢变化的明确联系，可以有力地补充严格的验证。对受试者进行纵向研究和重复采样也有助于评估生物标志物信号相对于不断变化的背景的稳健性。
02
—
标准化呼气采集程序
挥发性有机化合物生物标记物通常在呼出的气体中含量较低，因此可靠的收集和准确的检测是确定合适生物标记物的关键。与任何新兴技术一样，不同的研究人员开发了大量的呼气采集技术。在呼气检测成功应用于临床之前，需要制定一种标准化的方法，这种方法可以产生一致且可重复的结果，不受环境影响，也不需要专业技能或设备。
不同研究的呼气类型和收集量差别很大，而且收集呼气样本的行为也会影响结果。研究还发现，从20毫升的瓶子到5升的袋子都能收集到呼吸样本。欧洲呼吸学会特别工作组和自由呼吸项目（Breathe Free Project）都致力于更好地规范呼吸样本的采集，以确保不同研究结果的可比性。
通过在吸附管上对样品进行预浓缩，可以从更大体积的空气中收集更多的挥发性有机化合物，从而提高灵敏度。预浓缩样本在室温下可保持更长时间的稳定，而且体积更小、更易于运输和储存。此外，测量收集到的呼气量、收集特定的呼气组分以及以稳定的形式收集样本都有利于样本的处理和分析。
03
—
样本降噪
检测低丰度挥发性有机化合物的灵敏度不断提高，这也增加了在呼吸采集和分析过程中有效降噪的必要性。呼吸样本中既含有外源性挥发性有机化合物，也含有内源性挥发性有机化合物。外源性挥发性有机化合物可能来自环境（空气污染、清洁产品）和饮食（食物、饮料），是呼出气体中挥发性有机化合物的主要成分。而内源性挥发性有机化合物可以是局部的（来自呼吸道、胃或微生物组），也可以是全身的（从血液转移到呼气中）。
降低样本中的噪声在很大程度上取决于特定研究旨在调查哪些挥发性有机化合物。外源性挥发性有机化合物通常含量较高，因此更容易检测。相比之下，许多研究侧重于内源性挥发性有机化合物，在这些研究中，尽可能排除其他来源的挥发性有机化合物是有益的。因此，可以采取措施尽量降低呼气样本中的外源性挥发性有机化合物水平，以提高相关呼气生物标记物的检测水平。
控制受试者的行为，在采集呼气前的一段时间内不鼓励其进食、饮酒、吸烟等，是一种广泛使用的方法。这种方法可能有用，但最好适度，因为过多的限制可能会限制呼气测试今后在临床中的应用。
CASPER™ 便携式供气系统等工具可以大大减少呼气样本中的环境挥发性有机化合物。这对多地点研究尤为有利，因为外源性挥发性有机化合物会受到地理位置的影响。ReCIVA 呼吸采样器还能收集特定的呼吸组分，减少来自口腔、上呼吸道和/或胃等内部挥发性有机化合物源的噪音。一旦针对特定条件确定并验证了呼气生物标记物，降低背景的需求可能就不那么重要了，因为在许多情况下，可以使用更有针对性的化学分析，从而更容易确定关键的挥发性有机化合物特征，尽管存在背景噪声。
04
—
一致的样本处理和分析
GC-MS 被广泛认为是对呼气样本进行化学分析以发现挥发性有机化合物生物标记物的黄金标准。然而，它需要复杂、昂贵的设备和专业培训，限制了其在临床环境中的应用。此外，纯粹根据 GC-MS 模式发现生物标记物必须克服仪器校准、未知偏差和生物验证需求等问题。此类方法最好应用于验证研究，以检测已知的目标生物标志物。
除化学分析外，支持向量机、回归分析、随机森林、神经网络等更广泛的计算方法也在应用。
不同方法的数量和缺乏标准化显然限制了比较和合并数据集的能力。随着在不同情况下识别呼吸生物标记物的工作不断进行，继续探索生物标记物研究和识别方法以确保我们能得出最可靠的结果，并能切实用于诊断用途，这一点非常重要。通过明确我们的方法并设法了解不同结果之间的比较，可以提高不同研究之间的可比性。
05
—
确定VOCs及其生物相关性
有必要了解呼气中挥发性有机化合物的化学特性和生物来源。目前的发现研究将化合物识别为 GC-MS 图谱中的分子特征，但并非总能将这些特征与特定的化学结构联系起来。挥发性有机化合物在标准质谱库中的代表性通常很低，因此识别起来并不简单。我们必须继续对来自气相色谱-质谱仪和其他相关分析方法的挥发性有机化合物光谱进行鉴定和编目，以便对呼吸中更多的挥发性有机化合物进行化学鉴定。我们还必须谨慎行事，不要认为从质谱库中得到的暂定标识总是正确的，并在我们的研究中纳入更多的标准和生物特征。
即使知道了挥发性有机化合物的化学特性，也很少有挥发性有机化合物与生物过程有确凿的联系，因此需要进行更多的研究来确定挥发性有机化合物的生物起源，特别是与特定疾病的关系。Rianne Fijten 在她的博文中深入探讨了了解这些因果关系的必要性，但了解生物标志物的来源有助于验证它们的相关性，并为不同疾病的机制和影响提供新的见解。
呼吸分析在改善人类健康方面有着巨大的潜力，同时还能通过对各种健康状况提供便捷的筛查来减轻医疗系统的压力。技术已经发展到了可以实现这一目标的阶段，剩下的挑战主要集中在如何识别和验证呼气生物标记物方面加强规划、标准化和协调。通过应对这些挑战，可以推动呼气分析领域向前发展，并开始实现这一强大检测方法的临床潜力。